一種綠色熒光碳點及其制備方法和用途

1.本發明屬于納米材料及制備方法和用途，特別涉及一種綠色熒光碳點及其制備方法和用途。


背景技術：

2.由于印刷、農業和紡織工業產生有害污染物，環境承受著巨大壓力。檢測這些污染物是監測和控制環境污染的一項重要的全球任務(journal of the korean ceramic society.2020，1-11)。剛果紅是一種衍生自聯苯胺的偶氮染(chemosphere.2005，61，492-501)，對環境和人類均顯示出高毒性。在染料、紡織品、皮革、紙張、塑料、食品、化妝品和藥品等行業中使用染料和顏料，產生了大量的含剛果紅的廢水。剛果紅不易被微生物降解，并且在環境中高度穩定journal of environmental management.2019，242，229-237)。而且剛果紅進入人體后會轉化為聯苯胺，其有強烈的致癌作用(chemical engineering research and design.2016，109，824-834)。此外，剛果紅對人體健康還有許多其他負面影響，引起嘔吐，惡心，腹瀉，過敏性問題journal of colloid and interface science.2018，521，172-182)。然而，剛果紅的檢測并沒有像其他的偶氮染料如亞甲基藍，甲基橙，溴酚藍和結晶紫一樣受到關注journal of chromatography b.2005，826，244-251)。
3.當前，剛果紅的檢測方法包括傳統的uv-可見分光光度法journal of the korean ceramic society.2020，1-11)，以及新近開發的分光光度法(toxicological&environmental chemistry.2012，94，1886-1892)和電化學法(aminabhavi，microchemical journal.2019，146，387-392)。紫外可見分光光度法對剛果紅檢測的靈敏度較低，需要采用不同策略對水樣品中的剛果紅進行預濃縮，這一過程非常耗時并且需要大量樣品journal of the korean ceramic society.2020，1-11)?；诜止夤舛确ǖ膭偣t檢測受到金屬離子如cu(ii)，fe(iii)和cr(vi)的干擾，而且使用到鹽酸這種危險溶劑。電化學方法是通過在玻璃碳電極(glassy carbon electrode)上制造的氧化石墨烯納米顆粒記錄剛果紅在電化學降解過程中的循環伏安圖來建立的(aminabhavi，microchemical journal.2019，146，387-392)。這種方法會受到其他金屬鹽的干擾，例如氯化鋇，硫酸銨，乙酸銅和硝酸鉀(aminabhavi，microchemical journal.2019，146，387-392)。所有這些方法都具有操作時間長，靈敏度低，選擇性差，成本高和勞動強度大的缺點，且無法用于細胞或生物體的原位檢測。因此，有必要開發新的低成本、高靈敏、高效的用于細胞和生物體內的剛果紅檢測方法。
4.碳點(carbon dots，cds)是一種碳基熒光納米材料，自從在單壁碳納米管的處理過程中首次發現它們以來，近年來受到了廣泛關注(nano today.2020，33，100879)。由于其在發光，穩定性，生物相容性和低成本方面的突出優點，碳點已被廣泛作為熒光納米探針(acs nano.2014，8，4522-4529)、化學傳感器和生物傳感器(chemical society reviews.2015，44，362-381)、光電器件(chemical communications.2012，48，2692-2694)、
光催化反應劑(angewandte chemie international edition.2016，55，12470-12474)和生物醫藥journal of the american chemical society.2017，139，13147-13155)。近年來，碳點已經開始應用于環境污染物的檢測，主要包括金屬離子(chemical engineering journal.2020，126848)和染料(rsc advances.2019，9，29533-29540)的檢測。然而，據我們所知，尚未有cd用于檢測剛果紅的報道。


技術實現要素：

5.發明目的：本發明的目的是提供一種綠色、高光穩定性、高生物安全性的綠色熒光碳點。
6.本發明的另一目的是提供所述綠色熒光碳點的制備方法和用途。
7.技術方案：本發明的綠色熒光碳點mis-mpd-cds通過牙刷樹以及間苯二胺mpd通過一步水熱法制備得到。
8.具體包括如下步驟：
9.(1)將牙刷樹粉末和間苯二胺溶解于去離子水中，得到混合溶液，160-200℃下反應6-18h；
10.(2)將步驟(1)中得到的反應產物離心，收集上清液，過濾；
11.(3)將所得的碳點進行透析，冷凍干燥，即可。
12.進一步地，步驟(1)中，牙刷樹粉末和間苯二胺的濃度分別為1.5-5mg/ml，0.5-1.5mg/ml。
13.進一步地，步驟(1)中，所述水熱釜為有聚四氟乙烯內襯的高溫高壓水熱釜，容積為25-100ml。
14.進一步地，步驟(1)中，優選反應溫度為180℃，最優反應時間為12h。
15.所述綠色熒光碳點mis-mpd-cds用于細胞內剛果紅的的熒光檢測。檢測步驟如下：動物細胞、細菌或真菌與mis-mpd-cds共孵育一段時間后，用熒光顯微鏡進行熒光強度的觀察，用流式細胞儀進行熒光強度的檢測。通過定量細胞內的mis-mpd-cds熒光強度來檢測細胞內剛果紅。
16.其中，mis-mpd-cd的濃度為10-1000μg/ml，孵育時間為2-60min。
17.綠色熒光碳點mis-mpd-cds用于生物內剛果紅的的熒光檢測。檢測步驟如下：
18.生物體與mis-mpd-cd共孵育一段時間后，。在具有10
×
物鏡的熒光顯微鏡下，進行觀察，通過熒光強度的檢測用于定量分析生物體內的剛果紅濃度。
19.其中，mis-mpd-cd的濃度為50-1000μg/ml，孵育時間為30-120min。
20.本發明與現有技術相比，其顯著優點為：綠色熒光碳點mis-mpd-cds具有對剛果紅高靈敏度和高特異性的檢測能力，檢測限為5.8
×
10-8
m，不受其它環境污染物如金屬離子和燃料的干擾；mis-mpd-cds有很高的光穩定性，光照90min以內熒光強度幾乎無影響；mis-mpd-cds生物安全性也很優異，在50μg/ml的濃度下只殺傷10％的細胞，且幾乎無溶血性。更重要的是mis-mpd-cds不僅能能實現溶液中的剛果紅檢測，還可以實現細胞、生物體內的剛果紅檢測。mis-mpd-cds在食品、工業廢水等情況下為對剛果紅的快速檢測提供了有效方法。
21.有益效果：本發明的熒光碳點綠色、高光穩定性、高生物安全性，實現細胞及生物
體內剛果紅的快速、簡單、高靈敏性和高特異性的檢測。
附圖說明
22.圖1為熒光碳點mis-mpd-cds的透射電鏡成像圖；
23.圖2為熒光碳點mis-mpd-cds的zeta電位(zeta potential)檢測結果示意圖；
24.圖3為熒光碳點mis-mpd-cds的熒光譜圖；
25.圖4熒光碳點mis-mpd-cds的熒光隨著剛果紅的加入逐漸減弱的熒光譜圖；
26.圖5為熒光碳點mis-mpd-cds的剛果紅檢測能力評價；
27.圖6為熒光碳點mis-mpd-cds的剛果紅檢測特異性評價；
28.圖7熒光碳點mis-mpd-cds用于細胞內剛果紅的檢測結果；
29.圖8為熒光碳點mis-mpd-cds用于斑馬魚的剛果紅的檢測結果；
30.圖9為熒光碳點mis-mpd-cds的穩定性評價；
31.圖10為mis-mpd-cds對動物細胞的細胞毒性(cytotoxicity)評價；
32.圖11為mis-mpd-cds對新鮮小鼠血紅細胞的溶血性評價。
具體實施方式
33.實施例1熒光碳點mis-mpd-cds的制備
34.把牙刷樹粉末和間苯二胺分別以1.5mg/ml和0.5mg/ml溶解于去離子水。將溶液轉移至25ml水熱反應器中，180℃下反應12h。冷卻至室溫后，離心取上清，用超純水、透過分子量1kda透析1d，過0.22μm濾膜，得到熒光碳點。
35.實施例2熒光碳點mis-mpd-cds的掃描電鏡觀察：
36.將過濾好的熒光碳點用去離子水稀釋，取10μl滴在潔凈的銅網上，用透射電鏡(jem-2100，jeol ltd，japan)進行觀察，如圖1所示。透射電鏡觀察的結果顯示該碳點mis-mpd-cds近似球形結構且分布均勻。
37.實施例3熒光碳點mis-mpd-cds的粒徑分布檢測
38.按比例尺測量圖1掃描電鏡觀察得到的碳點mis-mpd-cd的直徑，統計其粒徑分布，如圖2所示，顯示該碳點mis-mpd-cds的平均粒徑約為19.6nm；
39.實施例4熒光碳點mis-mpd-cds的電位檢測
40.將獲得的熒光碳點置于zeta電位(zeta potential)檢測池中，使用納米粒度和zeta電位分析儀(malvern instruments，zetasizer nano zs，uk)測量其zeta電位，檢測結果如圖3所示。電位檢測結果顯示該mis-mpd-cds帶負電(-6.7mv)；
41.實施例5熒光碳點mis-mpd-cds的剛果紅檢測能力的效果評價
42.16.6μl 3mg/ml碳點與100μm不同體積的剛果紅(cr)混合，使用去離子水將每種混合物的最終體積調整為1ml，以達到不同的cr終濃度。在440nm激發下測量混合溶液的熒光發射光譜，如圖4所示，隨著剛果紅濃度的提高，mis-mpd-cds的在510nm處的熒光逐漸減弱。工作曲線由log(f
0-f)/f0和cr濃度繪制。f0和f分別是沒有和有cr的碳點的熒光強度，如圖5所示。mis-mpd-cds的(f
0-f)/f0比值和剛果紅濃度的線性檢測范圍為0.2-1.2μm。由檢測限的計算公式獲得mis-mpd-cds的剛果紅檢測限為5.8
×
10-8
m。
43.檢測限(lod)的計算公式如下：
44.lod＝3σ/k
45.其中k是線性范圍的斜率，σ是空白的標準偏差(n＝11)。
46.實施例6熒光碳點mis-mpd-cds的熒光檢測特異性評價
47.類似實施例5，將熒光碳點mis-mpd-cd和其它其他環境污染物(亞甲基藍mb、溴酚藍bpb和結晶紫cv)、金屬離子(fe
3+
、ca
2+
、mg
2+
、k
+
、mn
2+
、zn
2+
、cu
2+
、hg
2+
、fe
2+
、ag
+
、和cd
2+
)和重要生物分子(人血清白蛋白hsa、甘氨酸gly、三聚氰胺mel、多巴胺da和谷胱甘肽gsh)進行混合，測得熒光碳點mis-mpd-cd的熒光變化。如圖6所示，熒光碳點mis-mpd-cd的熒光不受其它環境污染物和重要生物分子的影響，表明mis-mpd-cd對剛果紅的檢測具有高特異性。
48.實施例7熒光碳點mis-mpd-cds在實際樣品中的剛果紅檢測
49.從鯧魚和鴉片魚中收集組織樣本，切碎并冷凍。將10g解凍的組織溶解在含有30ml乙腈的50ml燒杯中，然后超聲處理1h。8000rpm離心5min后收集上清液。上清液中加入無水硫酸鈉。然后通過旋轉蒸發儀蒸發乙腈，并使用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)分散樣品。取樣品與16.66μl的3mg/ml碳點mis-mpd-cds混合，最終體積調節至1 ml。在440nm激發下檢測混合溶液的熒光發射光譜。使用碳點mis-mpd-cds檢測工業廢水中的cr與上述相同。如表1，在魚類組織或工業廢水中均未檢測到cr。額外添加cr后，檢出cr的準確率率為94％-109％，相對標準偏差(rsd)小于6.6％，足以在實際樣品中進行定量測量。這些發現表明，基于mis-mpd-cds的熒光測量在檢測真實樣品中的cr方面具有巨大潛力。
50.表1為熒光碳點mis-mpd-cds對真實樣品中的剛果紅檢測能力評價。
[0051][0052]
實施例8熒光碳點mis-mpd-cds在細胞中的剛果紅檢測
[0053]
人肺癌細胞(a549)在dmem中培養，將細胞以每孔5
×
103個細胞的密度接種于96孔板中；白色念珠菌(c.albicans)培養于ym培養基，離心收集；大腸桿菌(e.coli)和金黃色葡萄球菌(s.aureus)培養于lb培養基，離心收集。將對應的培養基更換為含有mis-mpd-cds(50μg/ml)的培養基，并在37℃下孵育不同時間(2、10、30、40和60min)。然后，使用具有63
×
油浸物鏡的共聚焦激光掃描顯微鏡(clsm，leica sp8)檢查細胞成像。在激發波長為488nm，熒光發射為500-550nm。如圖7，在a459細胞、白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中，隨
著剛果紅濃度提高，mis-mpd-cds發出的熒光強度逐漸降低，表明熒光碳點mis-mpd-cds可用于動物、真菌和細菌細胞中的剛果紅檢測。
[0054]
實施例9熒光碳點mis-mpd-cds在斑馬魚中的剛果紅檢測
[0055]
使用標準斑馬魚e3培養基在2ml管中室溫培養5天(受精后天數)的斑馬魚。首先，斑馬魚幼蟲與0、5、15和20μm cr共孵育4h，然后用100μg/ml mis-mpd-cd處理1h。然后在具有10
×
物鏡的共聚焦激光掃描顯微鏡(clsm，leica sp8)上獲得斑馬魚的共聚焦圖像。激發波長為488nm，熒光發射為500
??
550nm。如圖8，在斑馬魚體內，隨著剛果紅濃度提高，mis-mpd-cds發出的熒光強度逐漸降低，表明熒光碳點mis-mpd-cds可用于生物內的剛果紅檢測。
[0056]
實施例10熒光碳點mis-mpd-cds的穩定性評價
[0057]
使用365nm(20mw)的紫外燈照射碳點溶液不同的時間，并通過熒光分光光度計測量510nm(λex＝440nm)下照射的碳點溶液的相應熒光強度。同樣，不同nacl濃度(0.0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5m)和不同溫(30、40、50、60、70、80、90和100℃)下的碳點溶液的熒光強度也被記錄下來。如圖9，在紫外燈照射30min以內、nacl濃度2.5m以下、溫度30-100℃以內，mis-mpd-cds的熒光強度都沒有明顯變化。
[0058]
實施例11熒光碳點mis-mpd-cds對動物細胞的細胞毒性(cytotoxicity)研究
[0059]
在含有10％胎牛血清和100iu/ml青霉素的dulbecco改良eagle培養基(dmem)中培養hpaepic(hp)細胞(正常人肺細胞)和hep g2細胞(人肝癌細胞)，培養溫度為37℃，5％co2。將5
×
103個細胞轉移到96孔板的每個孔中并生長24h。然后，將細胞與碳點孵育24h，然后加入10μl 5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(mtt)再孵育4h。除去培養基后加入150μl dmso。最后，用酶標儀(multiskan fc，thermo scientific，usa)測量波長570nm處的吸光度。結果如圖10所示，該納米粒子對人體細胞幾乎無毒性。
[0060]
實施例12熒光碳點mis-mpd-cds對新鮮小鼠血紅細胞的溶血性研究
[0061]
通過4000rpm離心5min，從小鼠全血中提取紅細胞(rbc)，并重新懸浮在細胞用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中。將分離的rbc與碳點在37℃下孵育1h，形成濃度梯度。在4000rpm離心5min后，將上清液轉移到96孔板中，用酶標儀(multiskan fc，thermo fisher scientific，usa)記錄405nm處的吸光度并計算溶血率。分別以triton和無處理的紅細胞作為陽性對照和陰性對照。結果如圖11所示，該碳點對紅細胞的溶血性可忽略不計。